Аннотация
Введение. Развитие устойчивости к противоопухолевым препаратам обусловлено в том числе негенетическими изменениями. Эти процессы могут включать изменения экспрессии генов и активности транскрипционных факторов, а также эпигенетические механизмы, такие как метилирование ДНК, модификация гистонов и регуляция с помощью некодирующих РНК. Для изучения этих изменений применяется метод секвенирования нового поколения (NGS), который позволяет проводить полногеномный анализ, исследовать транскриптом и эпигеном опухолевых и нормальных тканей. С помощью NGS можно получить данные о профилях транскриптов, мутациях, геномных изменениях, а также посттранскрипционных модификациях, что помогает глубже понять механизмы формирования лекарственной резистентности. Цель исследования. Определить дифференциально экспрессируемые гены клеток меланомы линии B16 в модели in vivo для идентификации транскрипционных факторов и сигнальных путей, связанных с устойчивостью меланомы к алкилирующему агенту дакарбазину. Материал и методы. Моделирование меланомы осуществляли на мышах самок линии C57Bl6 (6–8 нед), подкожным введением клеток меланомы B16. На 8, 10 и 12 день после трансплантации опухоли животным опытной группы вводили внутрибрюшинно раствор дакарбазина (50 мг/кг массы тела животного). На 14 сутки извлекали опухолевый узел и осуществляли экстракцию и анализ РНК. Проводили секвенирование нового поколения (NGS) с приготовлением библиотек РНК с использованием poly-A обогащения и фрагментации. Дифференциально экспрессируемые гены выявляли с использованием программного обеспечения DESeq2. Проводили их анализ обогащения по функциональной принадлежности, определение сигнальных путей, насыщенных дифференциально экспрессируемыми генами и белок-белковых взаимодействий с использованием биоинформатических ресурсов KEGG и STRING соответственно, идентификацию транскрипционных факторов через базу TRANSFAC. Результаты. В клетках меланомы B16 после воздействия дакарбазином in vivo выявлено 670 дифференциально экспрессируемых генов, участвующих процессах ответа на повреждение ДНК, регуляции апоптоза и пролиферации, включая ключевые компоненты p53-зависимого апоптоза. Анализ сети белок-белковых взаимодействий выделил 32 ключевых гена, таких как PIDD1, CCNG1, DDIAS и EDA2R. Биоинформатический анализ показал, что экспрессию этих генов регулируют транскрипционные факторы, включая BCL6B, BEN, ZF5, E2F, FOXN4, GKLF, Sp1, Kaiso и p53. Заключение. Результаты исследования воздействия дакарбазином на клетки меланомы линии B16 in vivo показали изменение экспрессии 670 генов, которые, в свою очередь, имеют сайты связывания для 73 транскрипционных факторов, что отражает их участие в поддержании лекарственной устойчивости опухолевых клеток и открывает перспективы для улучшения диагностики, прогнозирования и разработки терапевтических стратегий.
Ключевые слова
Авторы и аффилиации
https://elibrary.ru/asiyth
Е.З. Лапкина(1), И.С. Зинченко(1), Е.И. Бондар(2, 3), Т.Г. Рукша(1)
1-Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого,
Российская Федерация, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; 2-ФГАОУ ВО «Сибирский
федеральный университет», Российская Федерация, 660041, Красноярский край, Красноярск,
пр. Свободный, 79; 3-Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр Сибирского
отделения Российской академии наук», Российская Федерация, 660036, Красноярск, ул. Академгородок, 50
Литература
Артюхов И.П., Гаврилюк Д.В., Дыхно Ю.А., Рукша Т.Г. Заболеваемость меланомой кожи взрослого населения Красноярского края. Сибирское медицинское обозрение. 2013; 6 (84): 37–42. [Artyukhov I.P., Gavrilyuk D.V., Dyhno Yu.A., Ruksha T.G. Zabolevaemost’ melanomoj kozhi vzroslogo naseleniya Krasnoyarskogo kraya. Sibirskoe medicinskoe obozrenie. 2013; 6 (84): 37–42 (In Russian)].
. Tian Y., Ma J., Wang H., Yi X., Wang H., Zhang H., Guo S., Yang Y., Zhang B., Du J., Shi Q., Gao T., Guo W., Li C. BCAT2 promotes melanoma progression by activating lipogenesis via the epigenetic regulation of FASN and ACLY expressions. Cell Mol Life Sci. 2023; 80: 315. DOI: 10.1007/s00018-023-04965-8.
. Zeng Z.M., Chen Y.Y., Wen X.C., Geng X.C., Zhu Y.X., Hao L.C., Dong Z.S., Yang J.F., Wang T.T., Zhang R.B., Sun Z.W., Zhang Y.H., Zheng K.B. Whole-transcriptome sequencing with ceRNA regulation network construction and verification in glioblastoma. Am. J. Transl Res. 2023; 15 (6): 4291–313.
. Vanni I., Pastorino L., Tanda E.T., Andreotti V., Dalmasso B., Solari N., Mascherini M., Cabiddu F., Guadagno A., Coco S., Allavena E., Bruno W., Pietra G., Croce M., Gangemi R., Piana M., Zoppoli G., Ferrando L., Spagnolo F., Queirolo P., Ghiorzo P. Whole-Exome Sequencing and cfDNA Analysis Uncover Genetic Determinants of Melanoma Therapy Response in a Real-World Setting. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (5): 4302. DOI: 10.3390/ijms24054302.
. Baltanas F.C., Santos E. Advances in Molecular Research of Oncogenes. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (8): 7222. DOI: 10.3390/ijms24087222.
. Kortylewski M., Jove R., Yu H. Targeting STAT3 affects melanoma on multiple fronts. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24 (2): 315–27. DOI: 10.1007/s10555-005-1580-1.
. Liu Y.X., Chen Y.J., Xu B.W., Fu X.Q., Ding W.J., Li S.A., Wang X.Q., Wu J.Y., Wu Y., Dou X., Liu B., Yu Z.L. Inhibition of STAT3 signaling contributes to the anti-melanoma effects of chrysoeriol. Phytomedicine. 2023; 109: 154572. DOI: 10.1016/j.phymed.2022.154572.
. Malekan M., Ebrahimzadeh M.A., Sheida F. The role of Hypoxia-Inducible Factor-1alpha and its signaling in melanoma. Biomed Pharmacother. 2021; 141: 111873. DOI: 10.1016/j.biopha.2021.111873.
. San Juan L, Cagigal M.L., Fernandez-Flores A., Mayorga M., Gandarillas A. Protooncogene MYC drives human melanocyte melanogenesis and senescence. Cancer Gene Ther. 2022; 29 (8–9): 1160–7. DOI: 10.1038/s41417-021-00424-3.
10. Zacarias-Fluck M.F., Massó-Vallés D., Giuntini F., González-Larreategui Í., Kaur J., Casacuberta-Serra S., Jauset T., Martinez-Martin S., Martin-Fernández G., Serrano Del Pozo E., Foradada L., Grueso J., Nonell L., Beaulieu M.E., Whitfield J.R., Soucek L. Reducing MYC’s transcriptional footprint unveils a good prognostic gene signature in melanoma. Genes Dev. 2023; 37 (7–8): 303–20. DOI: 10.1101/gad.350078.122.
11. Pei H., Li Y., Liu M., Chen Y. Targeting Twist expression with small molecules. Medchemcomm. 2016; 8 (2): 268-275. DOI: 10.1039/c6md00561f.
12. Arumi-Planas M., Rodriguez-Baena F.J., Cabello-Torres F., Gracia F., Lopez-Blau C., Nieto M.A., Sanchez-Laorden B. Microenvironmental Snail1-induced immunosuppression promotes melanoma growth. Oncogene. 2023; 42 (36): 2659–72. DOI: 10.1038/s41388-023-02793-5.
13. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. Washington (DC): National Academies Press (US). 2011. DOI: 10.17226/12910.
. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Available online at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc. 2010.
. Kim D., Paggi J.M., Park C. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 2019; 37: 907–15. DOI: 10.1038/s41587-019-0201-4.
. Anders S., Pyl P. T., Huber W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics (Oxford, England). 2015; 31 (2): 166–9. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu638.
. Love M.I., Huber W., Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014; 15: 550. DOI: 10.1186/s13059-014-0550-8.
. Ge S.X., Jung D., Yao R. ShinyGO: a graphical gene-set enrichment tool for animals and plants. Bioinformatics. 2020; 36 (8): 2628–9. DOI: 10.1093/bioinformatics/btz931.
. Szklarczyk D., Franceschini A., Wyder S., Forslund K., Heller D., Huerta-Cepas J., Simonovic M., Roth A., Santos A., Tsafou K. P., Kuhn M., Bork P., Jensen L. J., and von Mering C., STRING v10: protein–protein interaction networks, integrated over the tree of life, Nucleic Acids Research. 2015; 43: 447–52. DOI: 10.1093/nar/gku1003.
. Thomas P.D., Ebert D., Muruganujan A., Mushayahama T., Albou L.P., Mi H. PANTHER: Making genome-scale phylogenetics accessible to all. Protein Sci. 2022; 31 (1): 8–22. DOI: 10.1002/pro.4218
. Kanehisa M., Furumichi M., Sato Y., Matsuura Y., Ishiguro-Watanabe M. KEGG: biological systems database as a model of the real world. Nucleic Acids Res. 2025; 53 (D1): 672–7. DOI: 10.1093/nar/gkae909.
. Matys V., Kel-Margoulis O.V., Fricke E. TRANSFAC and its module TRANSCompel: transcriptional gene regulation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2006; 34 (Database issue): 108–10. DOI: 10.1093/nar/gkj143.
. Smoot M. E., Ono K., Ruscheinski J., Wang P. L., Ideker T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization, Bioinformatics. 2011; 27 (3): 431–2. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq675.
. Shannon P., Markiel A., Ozier O., Baliga N. S., Wang J. T., Ramage D., Amin N., Schwikowski B., and Ideker T., Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks, Genome Research. 2003; 13 (11): 2498–504. DOI: 10.1101/gr.1239303.
. Komina A.V., Palkina N.V., Aksenenko M.B., Lavrentev S.N., Moshev A.V., Savchenko A.A., Averchuk A.S., Rybnikov Y.A, Ruksha T.G. Semaphorin-5A downregulation is associated with enhanced migration and invasion of BRAF-positive melanoma cells under vemurafenib treatment in melanomas with heterogeneous BRAF status. Melanoma Res. 2019; 29 (5): 544–8. DOI: 10.1097/CMR.0000000000000621.
. Flavahan W.A., Gaskell E., Bernstein B.E. Epigenetic plasticity and the hallmarks of cancer. Science. 2017; 357 (6348): eaal2380. DOI: 10.1126/science.aal2380.
. Reiter F, Wienerroither S, Stark A. Combinatorial function of transcription factors and cofactors. Curr Opin Genet Dev. 2017; 43: 73–81. DOI: 10.1016/j.gde.2016.12.007.
. Lu M., Muers M.R., Lu X. Introducing STRaNDs: shuttling transcriptional regulators that are non-DNA binding. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016; 17: 523–32. DOI:10.1038/nrm.2016.41.
29. Sergeeva E, Ruksha T, Fefelova Y. Effects of obesity and calorie restriction on cancer development. Int J Mol Sci. 2023; 24 (11): 9601. DOI: 10.3390/ijms24119601.
. Gu Y., Li A., Sun H., Li X., Zha H., Zhao J., Xie J., Zeng Z., Zhou L. BCL6B suppresses proliferation and migration of colorectal carcinoma cells through inhibition of the PI3K/AKT signaling pathway. Int. J. Mol. Med. 2018; 41 (5): 2660–8. DOI: 10.3892/ijmm.2018.3451.
. Li X., Guo M., Yang L., Cheng Z., Yu X., Han Z., Liu F., Sun Q., Han X., Yu J., Liang P. BCL6B hypermethylation predicts metastasis and poor prognosis in early-stage hepatocellular carcinoma after thermal ablation. J. Cancer Res Ther. 2021; 17 (3): 644–51. DOI: 10.4103/jcrt.JCRT_1504_20.
. Katoh M., Katoh M. Characterization of human FOXN4 gene in silico. Int. J. Mol. Med. 2004; 14 (5): 949–53.
. Liu K., Zhang J., Xiao Y., Yang A., Song X., Li Y., Chen Y., Hughes T.R., Min J. Structural insights into DNA recognition by the BEN domain of the transcription factor BANP. J Biol Chem. 2023; 299 (6): 104734. DOI: 10.1016/j.jbc.2023.104734.
. Wassmann S., Wassmann K., Jung A., Velten M., Knuefermann P., Petoumenos V., Becher U., Werner C., Mueller C., Nickenig G. Induction of p53 by GKLF is essential for inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells. J. Mol. Cell. Cardiol. 2007; 43 (3): 301–7. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2007.06.001.
. Dimova D. K., Dyson N. J. The E2F transcriptional network: old acquaintances with new faces. Oncogene.2005; 24: 2810–26.
. Fajas L., Landsberg R.L., Huss-Garcia Y., Sardet C., Lees J.A., Auwerx J. E2Fs regulate adipocyte differentiation. Dev Cell. 2002; 3 (1): 39–49. DOI:10.1016/s1534-5807(02)00190-9.
. Fang Z., Lin M., Chen S., Liu H., Zhu M., Hu Y., Han S., Wang Y., Sun L., Zhu F., Xu C., Gong C. E2F1 promotes cell cycle progression by stabilizing spindle fiber in colorectal cancer cells. Cell Mol Biol Lett. 2022; 27 (1): 90. DOI: 10.1186/s11658-022-00392-y.
. Li J., Bi W., Lu F., Pan B., Xiong M., Nasifu L., Nie Z., He B. Prognostic role of E2F1 gene expression in human cancer: a meta-analysis. BMC Cancer. 2023; 23 (1): 509. DOI: 10.1186/s12885-023-10865-8.
. Wang J., Dai W., Zhang M. E2F1 induced neuroblastoma cell migration and invasion via activation of CENPE/FOXM1 signaling pathway. Int J Neurosci. 2024; 134 (5): 530–42. DOI: 10.1080/00207454.2022.2126772.
. Shah Z.A., Nouroz F., Ejaz S., Tayyeb A. An Insight into the Role of E2F1 in Breast Cancer Progression, Drug Resistance, and Metastasis. Curr Mol Med. 2023; 23 (4): 365–76. DOI: 10.2174/1566524022666220308095834.
. Meng P., Bedolla R.G., Yun H., Fitzpatrick J.E., Kumar A.P., Ghosh R. Contextual role of E2F1 in suppression of melanoma cell motility and invasiveness. Mol. Carcinog. 2019; 58 (9): 1701–10. DOI: 10.1002/mc.23043.
. Hsu J., Sage J. Novel functions for the transcription factor E2F4 in development and disease. Cell Cycle. 2016; 15 (23): 3183–90. DOI: 10.1080/15384101.2016.1234551.
. Ma Y., Freeman S.N., Cress W.D. E2F4 deficiency promotes drug-induced apoptosis. Cancer Biol Ther. 2004; 3 (12): 1262–9. DOI: 10.4161/cbt.3.12.1239.
. Plesca D., Crosby M.E., Gupta D., Almasan A. E2F4 function in G2: maintaining G2-arrest to prevent mitotic entry with damaged DNA. Cell Cycle. 2007; 6 (10): 1147–52. DOI: 10.4161/cc.6.10.4259.
. Qi L., Ren Z., Li W. E2F4 transcription factor is a prognostic biomarker related to immune infiltration of head and neck squamous cell carcinoma. Sci Rep. 2022; 12 (1): 12132. DOI: 10.1038/s41598-022-16541-4.
. Jusino S., Rivera-Rivera Y., Chardón-Colón C., Ruiz-Justiz A.J., Vélez-Velázquez J., Isidro A., Cruz-Robles M.E., Bonilla-Claudio M., Armaiz-Pena G.N., Saavedra H.I. E2F3 drives the epithelial-to-mesenchymal transition, cell invasion, and metastasis in breast cancer. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2021; 246 (19): 2057–71. DOI: 10.1177/15353702211035693.
. Humbert P.O., Verona R., Trimarchi J.M., Rogers C., Dandapani S., Lees J.A. E2f3 is critical for normal cellular proliferation. Genes Dev. 2000; 14 (6): 690–703.
. Wei L., Bai Y., Na L., Sun Y., Zhao C., Wang W. E2F3 induces DNA damage repair, stem-like properties and therapy resistance in breast cancer. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2023; 1869 (8): 166816. DOI: 10.1016/j.bbadis.2023.166816.
. Trikha P., Sharma N., Pena C, Reyes A., Pécot T., Khurshid S., Rawahneh M., Moffitt J., Stephens J.A, Fernandez S.A., Ostrowski M.C., Leone G. E2f3 in tumor macrophages promotes lung metastasis. Oncogene. 2016; 35 (28): 3636–46. DOI: 10.1038/onc.2015.429.
. Wu L., Wan S., Li J., Xu Y., Lou X., Sun M., Wang S. Expression and prognostic value of E2F3 transcription factor in non-small cell lung cancer. Oncol Lett. 2021; 21 (5): 411. DOI: 10.3892/ol.2021.12672.
. Donaldson N.S., Pierre C.C., Anstey M.I., Robinson S.C., Weerawardane S.M., Daniel J.M. Kaiso represses the cell cycle gene cyclin D1 via sequence-specific and methyl-CpG-dependent mechanisms. PLoS One. 2012; 7 (11): e50398. DOI: 10.1371/journal.pone.0050398.
. Dai S.D., Wang Y., Miao Y., Zhao Y., Zhang Y., Jiang G.Y., Zhang P.X., Yang Z.Q., Wang E.H. Cytoplasmic Kaiso is associated with poor prognosis in non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 2009; 9: 178. DOI: 10.1186/1471-2407-9-178.
. Bocian A., Kędzierawski P., Kopczyński J., Wabik O., Wawruszak A., Kiełbus M., Miziak P., Stepulak A. Kaiso Protein Expression Correlates with Overall Survival in TNBC Patients. J. Clin. Med. 2023; 12 (1): 370. DOI: 10.3390/jcm12010370.
. Tian W., Yuan H., Qin S., Liu W., Zhang B., Gu L., Zhou J., Deng D. Kaiso phosphorylation at threonine 606 leads to its accumulation in the cytoplasm, reducing its transcriptional repression of the tumour suppressor CDH1. Mol Oncol. 2022; 16 (17): 3192–209. DOI: 10.1002/1878-0261.13292.
. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022; 29 (5): 946–60. DOI: 10.1038/s41418-022-00988-z.
. Pandya P., Kublo L., Stewart-Ornstein J. p53 Promotes Cytokine Expression in Melanoma to Regulate Drug Resistance and Migration. Cells. 2022; 11 (3): 405. DOI: 10.3390/cells11030405.
. Hientz K., Mohr A., Bhakta-Guha D., Efferth, T. The role of p53 in cancer drug resistance and targeted chemotherapy. Oncotarget. 2017; 8 (5): 8921–46. DOI: 10.18632/oncotarget.13475.